Protocollo per il monitoraggio genetico del lupo

Premessa

Negli ultimi anni si è assistito ad un' importante novità che si è aggiunta alle tecniche tradizionali di indagine sul lupo (Wolf Howling e Snow Tracking) che dà la possibilità di identificare i singoli esemplari tramite il DNA di campioni non invasivi: feci, urina, peli.

Raspatura di lupo nel terreno

Attraverso le feci il lupo marca il territorio. Questo semplice assunto evidenzia la connessione tra il dato di laboratorio e l'etologia della specie.
Fatta lupina

Fatta lupina

Una buona densità ed intensità di campioni, può portare a un salto di qualità fondamentale per il monitoraggio del lupo, potenziando anche le tecniche tradizionali. Le analisi genetiche consentono di identificare con certezza il singolo esemplare di lupo. Ciò permette attraverso le analisi delle marcature di esemplari noti di avere indicazioni sull'uso del territorio e sulle parentele. Il CTA CFS del Parco Nazionale delle Foreste Casentinesi esegue e coordina su campo il monitoraggio genetico sul lupo a partire dal 2002. I finanziamenti della regione Emilia Romagna e del Parco hanno consentito di mantenere attiva questa linea di indagine. Si riportano nel protocollo gli elementi fondamentali per la pianificazione e l'esecuzione di rilievi finalizzati alla raccolta di campioni per il monitoraggio genetico.

Organizzazione dei rilievi

E' necessario in primo luogo recuperare informazioni sul lupo e sui punti di marcatura noti. Con queste informazioni si può procedere a ipotizzare dei percorsi opportunistici che possano intersecare il più possibile le direttrici principali di spostamento dei branchi evidenziate dalle zone di più frequente marcatura.
sequenza di orme

Notare come il lupo, a differenza del cane, proceda lungo una linea retta. Questo comportamento gli permette una minore visibilità.

I percorsi devono essere assegnati a degli operatori che provvederanno a percorrerli con cadenza almeno mensile, raccogliendo eventuali fatte di marcatura se di tipologia idonea alle analisi. In questa fase è necessario in ogni caso memorizzare i luoghi di rinvenimento anche di fatte non idonee al campionamento in modo da arricchire la lista dei siti di marcatura da visitare.
Fatta di lupo vecchia di circa un mese

Fatta di lupo vecchia di circa un mese

L'organizzazione deve anche consentire che possano essere conferiti campioni non necessariamente provenienti dai percorsi di campionamento e da persone al di fuori degli operatori individuati. Nel dettaglio, una rete di raccolta e conservazione dei dati dovrebbe rispondere ai seguenti requisiti:
  1. gruppo di rilevatori che possano garantire continuità
  2. rete di percorsi opportunistici da ripetere con frequenza almeno mensile
  3. locali attrezzati con congelatore dove conferire i campioni raccolti
  4. modalità di marcatura univoche e stabili della provetta contenente il campione
  5. Scheda di raccolta e realizzazione di un database dei campioni raccolti organizzato al minimo come foglio di calcolo (es: excel o calc).

1- gruppo di rilevatori che possano garantire continuità

E' opportuno, soprattutto nel caso delle aree protette, che il gruppo principale dei rilevatori sia costituito da personale che svolge ordinariamente servizio nel territorio di indagine, CFS, guardia parco, tecnici degli enti, ecc. a questo nucleo possono essere aggiunti rilevatori ausiliari che di norma riescono a dare un contributo, ma non garantire presenza costante come, tesisti, volontari, ricercatori.
transetto:

Esame di una fatta da parte dei nostri volontari

E' necessaria una breve formazione iniziale e una condivisione di obbiettivo, curando i necessari aggiornamenti periodici ed i report periodici di motivazione. La conoscenza del territorio e l'economicità del rilievo che può essere associato ai normali servizi territoriali sono fondamentali per pianificare la continuità dei rilievi nel tempo

2- rete di percorsi opportunistici da ripetere con frequenza almeno mensile

Come accennato, il monitoraggio genetico si appoggia in primo luogo sui siti di marcatura ricorrente da parte degli esemplari dominanti dei branchi di lupo indagati. Per questo motivo è necessario avere un quadro di massima dei possibili siti di marcatura o almeno dei percorsi che possano con probabilità intercettare tali siti es: strade bianche, piste forestali, sentieri possono essere buoni percorsi da testare soprattutto se costituiscono anche limiti fisici, come linee di crinale.
Sito di marcatura

Sito di marcatura: crocevia tra sentieri

In questa fase le osservazioni pregresse di deposizioni fecali riportate dai rilevatori stessi e da altro soggetti sono utilissime per pianificare una prima rete di percorsi di campionamento. Stabilita la rete dei percorsi, si provvederà a testarla, tenendo conto che la massima probabilità di rinvenire le marcature esclude il periodo tardo primaverile ed estivo. Nel tempo i percorsi di marcatura diverranno semplicemente dei siti ricorrenti di marcatura da visitare, a cui senz'altro si aggiungeranno altri siti individuati in modo occasionale e che possono poi confermarsi come ricorrenti. L'indicazione di frequenza minima di ripetizione di un mese di ogni percorso è un parametro variabile, sarebbe opportuno aumentare la frequenza nei momenti in cui si rileva una maggiore probabilità di marcature in modo da avere l'occasione di raccogliere campioni freschi, che hanno maggiori probabilità di essere analizzati con successo.

3- locali attrezzati con congelatore dove conferire i campioni raccolti

L'organizzazione logistica per la conservazione dei campioni raccolti è fondamentale, è necessario avere dei punti di conferimento con dei congelatori meglio se dedicati e se verticali dedicando un cassetto a non più di 1 - 2 rilevatori. Nel luogo dove sarà posto il congelatore è necessario rendere disponibile il materiale per il campionamento, contenitori, boccette con alcool etilico, guanti monouso, schede di rilievo, pennarelli, nastro adesivo trasparente. La buona gestione di quanto sopra esposto garantisce una maggiore produttività dei rilevatori, spesso alcune inerzie di campionamento sono dovute alla mancanza di materiale o a congelatori pieni di altro materiale, in cui ci sono difficoltà anche a ritrovare i campioni (congelatori a pozzo, multiuso, con funghi sequestrati, carcasse ecc non sono l'ambiente ideale, spesso le boccette si rovesciano con perdita di alcool e con possibili contaminazioni genetiche tra campioni diversi).

4 - modalità di marcatura univoche e stabili della provetta contenente il campione

Ogni boccetta contenente un campione deve essere siglata in modo corretto. E' infatti frequente che siglature poco chiare o con materiale non idoneo non siano leggibili dopo poco tempo, vanificando il rilievo. Il campione quando viene posto in congelatore deve essere marcato in modo definitivo con il codice prescelto, a tale scopo si prestano i pennarelli indelebili, meglio se a vernice. Il metodo forse migliore è quello di usare etichette adesive sulla boccetta, scrivervi il codice e poi fasciare più volte l'etichetta con nastro adesivo trasparente. Il codice deve essere sulla boccetta, in alcuni casi viene siglato in modo ridondante, 2 volte sul corpo ed una sul tappo, è da escludere sempre la siglatura del solo tappo.

5- Scheda di raccolta e realizzazione di un database dei campioni raccolti

Particolare attenzione deve essere usata nella organizzazione dei dati, è necessario un archivio informatizzato, anche semplice, ma ben tenuto e facilmente caricabile su GIS. Ogni campione è corredato da una breve serie di informazioni che devono essere registrate, fondamentali sono i dati temporali e geografici. Non ci sono regole circa il modello di archivio da utilizzare, la migliore soluzione è quella di far caricare i dati direttamente ai rilevatori attraverso sistemi via web su un database centrale. Circa la scheda si riporta un fac simile di esempio, è chiaro che la stessa di fatto risulta coerente con i campi del database da costituire sulle indicazioni anche del laboratorio al quale sono affidate le analisi.
Scheda di raccolta campioni biologici

Scheda di raccolta campioni biologici

Il database può essere organizzato al minimo come foglio di calcolo (es: excel o calc). Fondamentale è la marcatura progressiva univo dei campioni sia a livello di database centrale che dei progressivi relativi ad ogni rilevatore. Si riporta l'elenco dei campi principali del database da costituire:
  • progressivo univoco del campione
  • progressivo univoco del rilevatore
  • codice del rilevatore
  • zona di raccolta (da concordare con il laboratorio di genetica)
  • data estesa
  • anno della raccolta
  • giorno della raccolta
  • mese della raccolta
  • nome del raccoglitore
  • località
  • coordinata longitudine (si consiglia gauss boaga o UTM Ed 50 o UTM WGS 84)
  • coordinata latitudine (si consiglia gauss boaga o UTM Ed 50 o UTM WGS 84)
  • tracciatura (transetto/fuori transetto)
  • qualità (deposizione : 1 gg - 1 settimana – 2 o più settimane)
  • marcatura (ricorrente, probabile ricorrente, non ricorrente)
  • priorità (di analisi: alta, ordinaria . Serve per eventuali urgenze tipo predazioni ecc)
  • note
a questa struttura di base possono essere aggiunti altri campi a discrezione dei rilevatori oltre ad alcuni campi vuoti necessari per inserire i dati delle analisi eseguite che si riportano con un esempio:
SpecieSessoGenotipoDefinitivoID_Infs
LupoMWFO97McertoWFC1683
In sostanza il database dovrà essere compilato in modo che sia garantita la corrispondenza fra il progressivo univoco del campione ed il progressivo usato dal laboratorio (nel caso di esempio ID_infs). Le date sono ridondanti, riportate sia in modo tradizionale esteso, con formattazione tipo 00/00/000, sia separando giorno, mese, anno in colonne diverse, in modo da lavorare più facilmente con le aggregazioni statistiche. Fondamentale è chiarire il sistema di coordinate da utilizzare ed il datum di riferimento. Non deve accadere di avere dati misti che fanno riferimento a sistemi e datum differenti sulle stesse colonne, si può aumentare i formati di coordinate possibili, ma solo creando nuove coppie di colonne per ogni sistema. Anche nella sua forma semplice di foglio di calcolo, il database potrà essere facilmente georeferenziato e inserto in GIS se le coordinate sono ben compilate.  

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